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常見蛋白質(zhì)印跡問題的提示和技巧

更新時(shí)間:2024-01-03      點(diǎn)擊次數(shù):629

蛋白質(zhì)印跡是研究實(shí)驗(yàn)室普遍使用的一種技術(shù),用于研究感興趣的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡用于抗體驗(yàn)證、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究以及許多其他應(yīng)用。1然而,生成可解釋的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果可能具有挑戰(zhàn)性。以下是一些常見問題以及解決方法。

高背景

可能是由于嘗試這個(gè)
高抗體濃度使用一抗和二抗進(jìn)行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對照。
封閉液使用新鮮的封閉液,增加封閉時(shí)間/溫度,嘗試不同的封閉劑。
印跡在封閉/洗滌過程中干燥確保膜在封閉和清洗步驟中被充分覆蓋。
洗得不夠增加洗滌次數(shù)和洗滌液體積。確保至少洗滌 3 次,每次 5 分鐘。
膠片曝光過度嘗試較短的曝光時(shí)間。















沒信號

可能是由于嘗試這個(gè)
抗體濃度太低使用一抗和二抗進(jìn)行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對照。
樣品中目標(biāo)含量低增加凝膠上的蛋白質(zhì)濃度。建議滴定。
一抗和二抗不匹配確保二抗針對一抗的宿主物種。
轉(zhuǎn)移問題使用帶有顏色的蛋白質(zhì)標(biāo)記來檢查轉(zhuǎn)移。使用對照蛋白優(yōu)化轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移前檢查是否有氣泡。
洗次數(shù)太多減少洗滌次數(shù)。















多頻段

可能是由于嘗試這個(gè)
凝膠超載滴定加載在凝膠上的蛋白質(zhì)樣品。
使用過多抗體使用一抗和二抗進(jìn)行滴定。包括已知的蛋白質(zhì)對照。
膠片曝光過度嘗試較短的曝光時(shí)間。
阻塞問題使用新鮮的封閉液,增加封閉時(shí)間/溫度,嘗試不同的封閉劑。
目標(biāo)蛋白的翻譯后修飾研究發(fā)表了目標(biāo)蛋白翻譯后修飾的例子,可以提供生物學(xué)解釋(即磷酸化、糖基化、核糖基化)。
翻譯后裂解許多蛋白質(zhì)被合成為前蛋白質(zhì),然后被切割成活性形式,例如前半胱天冬酶。研究針對您的目標(biāo)發(fā)布的示例。
拼接變體選擇性剪接可能會產(chǎn)生由同一基因產(chǎn)生的不同大小的蛋白質(zhì)。研究針對您的目標(biāo)發(fā)布的示例。


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